摘要

本文介紹了一種陽性轉(zhuǎn)染細胞親和分選方法及試劑盒，該方法通過構(gòu)建一種基于細胞膜表面定位熒光蛋白標簽的親和分選系統(tǒng)，實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)染陽性細胞的高效分選。實驗結(jié)果表明，該系統(tǒng)具有操作簡便、細胞損傷小、適用性廣等優(yōu)點，為基因功能研究提供了有力工具。

引言

細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中的一種重要技術(shù)手段，它可以將外源DNA、RNA或其他生物大分子導(dǎo)入細胞內(nèi)，從而實現(xiàn)對細胞功能的研究和調(diào)控。然而，在難轉(zhuǎn)染細胞中，如淋巴瘤/白血病細胞以及原代細胞，轉(zhuǎn)染效率往往較低，這限制了這些細胞為基礎(chǔ)的功能研究。因此，如何在難轉(zhuǎn)染細胞中進一步提高陽性率成為關(guān)鍵問題。

目前，提高陽性細胞比例的策略主要包括抗生素藥物篩選、流式細胞熒光分選（FACS）和磁性細胞分選（MACS）等方法。然而，這些方法存在操作復(fù)雜、實驗周期長、儀器昂貴、細胞損傷大等局限性。因此，開發(fā)一種操作快速、簡單，成本低，適用性廣，并且對細胞干擾較小的富集轉(zhuǎn)染陽性細胞的方法顯得尤為重要。

本研究旨在構(gòu)建一種基于磁珠親和分選的細胞分離系統(tǒng)，實現(xiàn)快速、高效的富集轉(zhuǎn)染陽性細胞。通過構(gòu)建一種可高效分選轉(zhuǎn)染陽性細胞的親和分選系統(tǒng)，在表達載體上編碼融合了膜定位信號、親和標簽標記的熒光蛋白，熒光蛋白和膜定位信號在轉(zhuǎn)染陽性的細胞融合表達，從而實現(xiàn)對轉(zhuǎn)染陽性細胞的高效分選。

材料與方法

材料

1. 細胞株：Lenti-X293T細胞、前列腺癌細胞22Rv1、白血病細胞K-562及Jurkat細胞。

2. 表達載體：包含膜定位信號、熒光蛋白及親和分選標簽的編碼序列的質(zhì)粒載體，如pEGFP-C2。

3. 磁珠：Magrose Strep-Tactin磁珠。

4. 試劑：某品牌脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、某品牌DPBS溶液、某品牌BSA。

5. 儀器：某品牌流式細胞儀、某品牌激光共聚焦熒光顯微鏡。

方法

1. 細胞培養(yǎng)：將Lenti-X293T細胞、前列腺癌細胞22Rv1、白血病細胞K-562及Jurkat細胞在相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

2. 基因構(gòu)建：通過PCR擴增目的基因，并克隆至載體pEGFP-C2中，構(gòu)建包含膜定位信號、親和分選標簽及熒光蛋白的表達框。具體步驟如下：

• 使用SignalP-5.0 Server在線分析獲取膜定位信號的編碼序列以及信號肽剪切位點。

• 通過多重PCR將膜定位信號、親和分選標簽及熒光蛋白的編碼序列融合，并通過AgeI/BglII酶切連接的方式克隆到pEGFP-C2載體中。

3. 轉(zhuǎn)染：采用某品牌脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體導(dǎo)入細胞中。

4. 親和分選：

• 將轉(zhuǎn)染后的細胞與Magrose Strep-Tactin磁珠孵育，使磁珠與細胞表面的親和標簽結(jié)合。

• 通過外加磁場或自然沉降方式固定磁珠-細胞復(fù)合物。

• 使用溫和的洗脫緩沖液（含有0.05~0.15%BSA的DPBS溶液）將結(jié)合的細胞從磁珠上釋放出來，實現(xiàn)陽性細胞的親和分選。

5. 檢測與定量：

• 使用某品牌流式細胞儀檢測分選前后細胞的陽性率。

• 通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察不同分選標簽在細胞膜外層的定位情況。

實驗結(jié)果

1. 分選標簽的細胞膜定位：將六種不同分選標簽的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Lenti-X293T細胞，通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，六種基于TST-EGFP的分選標簽分子都可以高水平的表達并且有效的定位到細胞膜上。其中，三種GPI膜錨定類型的分選標簽不僅具有良好的膜定位效果，并且細胞擁有正常的形態(tài)。

2. 轉(zhuǎn)染陽性細胞的親和分選：將六種分選標簽質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到三種細胞中，包括懸浮生長的白血病細胞K-562，貼壁生長的Lenti-X293T細胞和前列腺癌細胞22Rv1，使用Strep-Tactin磁珠分選陽性細胞并通過流式細胞術(shù)測定不同變體對陽性細胞的分選效率。結(jié)果表明，六種分選標簽在不同細胞系中均表現(xiàn)出了有效的富集轉(zhuǎn)染陽性細胞的能力。尤其是基于GPI膜錨定的三種分選標簽（TST-EGFP-GPI BY55，TST-EGFP-GPI DAF，TST-EGFP-GPI CEAM7），其富集陽性細胞的能力顯著高于基于跨膜結(jié)構(gòu)域的分選標簽。

3. 難轉(zhuǎn)染細胞的分選效果：在難轉(zhuǎn)染的Jurkat白血病細胞中對三種基于GPI膜錨定分選標簽進行了轉(zhuǎn)染陽性細胞分選實驗。結(jié)果表明，這三種分選標簽也表現(xiàn)出了高效的陽性細胞分離能力。經(jīng)過分選，TST-EGFP-GPI BY55，TST-EGFP-GPI DAF，和TST-EGFP-GPI CEAM7三種分選標簽可將陽性細胞比例從13%分別提高到67%，77%和63%。

4. 分選效率的優(yōu)化：通過自然沉降的方式而不是依賴外部磁場的作用分離結(jié)合了細胞的磁珠，發(fā)現(xiàn)在K-562細胞中經(jīng)過TST-EGFP-GPI BY55分選標簽富集之后，轉(zhuǎn)染陽性細胞的比例達到95%以上。

討論

本研究構(gòu)建了一種基于磁珠親和分選的細胞分離系統(tǒng)，實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)染陽性細胞的高效分選。該系統(tǒng)通過在表達載體上編碼融合了膜定位信號、親和標簽標記的熒光蛋白，使熒光蛋白和膜定位信號在轉(zhuǎn)染陽性的細胞融合表達?；谠撚H和分選系統(tǒng)，膜定位信號將熒光蛋白定位到細胞膜外表面，確保了技術(shù)人員可以直觀的通過流式細胞儀或者熒光顯微鏡來評估轉(zhuǎn)染陽性細胞比例。

親和標簽的使用讓技術(shù)人員可以通過磁珠分選的方式來快速高效的分離轉(zhuǎn)染陽性細胞。在本研究中，Twin-Strep-tag（TST）作為一種理想的親和標簽短肽，與Strep-Tactin蛋白具有更高的親和力，被融合到綠色熒光蛋白分子的N端，作為親和分選標簽分子。實驗結(jié)果表明，基于GPI膜錨定的分選標簽具有更高的富集陽性細胞的能力。

此外，該系統(tǒng)的優(yōu)勢在于操作簡便、細胞損傷小、適用性廣。與現(xiàn)有的流式細胞熒光分選（FACS）和磁性細胞分選（MACS）等方法相比，該系統(tǒng)不需要昂貴的實驗儀器，實驗成本低，且操作簡便。通過調(diào)整磁珠的使用量即可在同一時間和批次處理不同數(shù)量級的細胞樣品，省時省力，且通量幾乎不受限制。

在難轉(zhuǎn)染細胞中，該系統(tǒng)也表現(xiàn)出了高效的陽性細胞分離能力。這對于以難轉(zhuǎn)染細胞為基礎(chǔ)的功能研究具有重要意義。通過該系統(tǒng)，可以實現(xiàn)對難轉(zhuǎn)染細胞中基因遞送效率的顯著提高，為后續(xù)的基因功能研究提供了有力工具。

研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

本研究的創(chuàng)新之處在于構(gòu)建了一種基于細胞膜表面定位熒光蛋白標簽的親和分選系統(tǒng)，實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)染陽性細胞的高效分選。該系統(tǒng)具有操作簡便、細胞損傷小、適用性廣等優(yōu)點，為基因功能研究提供了有力工具。

在應(yīng)用前景方面，該系統(tǒng)可以廣泛應(yīng)用于各種類型的實驗研究，包括基因過表達分析、基因敲降分析、報告基因分析、基因編輯分析以及相關(guān)的細胞功能研究實驗等。通過將分選標簽的表達框插入到其他類型的載體上，即可將該轉(zhuǎn)染陽性細胞的分選方法應(yīng)用于不同類型的實驗研究。

此外，該系統(tǒng)還可以與其他技術(shù)相結(jié)合，如基因組編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）、高通量測序技術(shù)等，進一步拓展其在基因功能研究中的應(yīng)用范圍。

結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了一種基于磁珠親和分選的細胞分離系統(tǒng)，實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)染陽性細胞的高效分選。該系統(tǒng)通過在表達載體上編碼融合了膜定位信號、親和標簽標記的熒光蛋白，使熒光蛋白和膜定位信號在轉(zhuǎn)染陽性的細胞融合表達。實驗結(jié)果表明，該系統(tǒng)具有操作簡便、細胞損傷小、適用性廣等優(yōu)點，為基因功能研究提供了有力工具。

在未來的研究中，將進一步優(yōu)化該系統(tǒng)，提高其分選效率和穩(wěn)定性。同時，將探索該系統(tǒng)在更多類型細胞中的應(yīng)用，以及與其他技術(shù)相結(jié)合的可能性，為基因功能研究提供更加全面和深入的工具和方法。