摘要

在肝細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)加強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP）與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）雙基因，以探討其在肝細(xì)胞功能研究中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)采用某品牌電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并通過熒光顯微鏡觀察EYFP表達(dá)，同時(shí)利用ELISA檢測VEGF蛋白水平。結(jié)果表明，雙基因共轉(zhuǎn)染效率高，為肝細(xì)胞基因功能研究提供了可靠工具。

引言

肝細(xì)胞作為肝臟的主要功能細(xì)胞，在代謝、解毒及合成等多種生理過程中發(fā)揮重要作用。近年來，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已成為研究肝細(xì)胞功能的重要手段。加強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP）作為一種常用的報(bào)告基因，能夠直觀地反映基因表達(dá)情況；而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）則在血管生成及細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用。本研究通過共轉(zhuǎn)染技術(shù)，將EYFP與VEGF雙基因?qū)敫渭?xì)胞，旨在建立一種高效的雙基因表達(dá)系統(tǒng)，為肝細(xì)胞功能研究提供新的實(shí)驗(yàn)方法。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與儀器

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)采用人肝癌細(xì)胞系HepG2，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

EYFP基因與VEGF基因分別克隆至某試劑提供的pCDNA3.1載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDNA3.1-EYFP和pCDNA3.1-VEGF。質(zhì)粒通過某品牌分子雜交儀進(jìn)行純化，濃度測定后備用。

1.3 主要儀器

電穿孔儀（威尼德）：用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

熒光顯微鏡（某品牌）：用于觀察EYFP表達(dá)。

紫外交聯(lián)儀（威尼德）：用于DNA交聯(lián)實(shí)驗(yàn)。

原位雜交儀（威尼德）：用于基因表達(dá)定位。

ELISA檢測儀（某品牌）：用于VEGF蛋白定量。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取1 μg pCDNA3.1-EYFP與1 μg pCDNA3.1-VEGF混合，加入某試劑提供的轉(zhuǎn)染試劑中，輕輕混勻后室溫靜置15分鐘。將混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，使用某品牌電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參數(shù)設(shè)置為電壓200 V，脈沖時(shí)間10 ms。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。

2.2 熒光顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次。在熒光顯微鏡下觀察EYFP表達(dá)情況，激發(fā)波長為514 nm，發(fā)射波長為527 nm。拍照記錄熒光強(qiáng)度及分布。

2.3 VEGF蛋白檢測

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清液，使用某試劑提供的ELISA試劑盒檢測VEGF蛋白濃度。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，使用某品牌ELISA檢測儀讀取吸光度值，計(jì)算VEGF濃度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3. 結(jié)果

3.1 轉(zhuǎn)染效率

熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞中EYFP表達(dá)明顯，熒光強(qiáng)度較高，表明轉(zhuǎn)染效率達(dá)到預(yù)期。

3.2 VEGF表達(dá)

ELISA檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清液中VEGF蛋白濃度顯著高于未轉(zhuǎn)染組（P<0.05），表明VEGF基因成功表達(dá)并分泌至細(xì)胞外。

4. 討論

本研究成功建立了肝細(xì)胞雙基因共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，通過EYFP與VEGF的共表達(dá)，為肝細(xì)胞功能研究提供了新的實(shí)驗(yàn)工具。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，某品牌電穿孔儀在轉(zhuǎn)染過程中表現(xiàn)出高效性和穩(wěn)定性，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

5. 結(jié)論

本研究通過共轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)現(xiàn)了肝細(xì)胞中EYFP與VEGF雙基因的高效表達(dá)，為肝細(xì)胞功能研究提供了可靠的方法。未來可進(jìn)一步探討雙基因共表達(dá)在肝細(xì)胞代謝及血管生成中的作用。

參考文獻(xiàn)

1.王金林,周曉東,閔軍,等.血管內(nèi)皮生長因子基因轉(zhuǎn)染對肝細(xì)胞移植的影響[J].中華肝臟病雜志.2001,(3).DOI:10.3760/j.issn:1007-3418.2001.03.016 .

2.劉彥文,盧春彬,林勇,等.綠色熒光蛋白基因GFP真核表達(dá)載體PCT K GFP的構(gòu)建[J].中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).1999,(0S1).8-10.

3.Dabbah B,Kraizer Y,Baruch Y,等.Effect of vascular endothelial growth factor on hepatic regenerative activity following partial hepatectomy in rats.[J].Journal of Hepatology: The Journal of the European Association for the Study of the Liver.1999,30(5).

4.T. Tokiwa,X-D. Zhou,J. Kano.Isolation and primary culture of adult pig hepatocytes[J].Methods in Cell Science.1998,19(4).

5.Chalfie, Martin,Tu, Yuan.Green fluorescent protein as a marker for gene expression.[J].科學(xué)（上海）.1994,263(5148).802.

6.Yoshifumi Watanabe,,Hirokazu Nomoto,,Ryuichi Takezawa,,等.Highly Efficient Transfection into Primary Cultured Mouse Hepatocytes by Use of Cation-Liposomes: An Application for Immunization[J].The Journal of Biochemistry.1994,116(6).1220-1226.