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7-24
基因克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復(fù)制的載體DNA連接，然后將其轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞或受體生物進(jìn)行表達(dá)或進(jìn)一步研究的分子操作的過程，因此基因克隆又稱DNA克隆、分子克隆、基因重組或重組DNA技術(shù)?；蚩寺∩婕耙幌盗械姆肿由飳W(xué)技術(shù)，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導(dǎo)入宿主細(xì)胞技術(shù)和重組子篩選技術(shù)等等。為了方便大家學(xué)習(xí)和交流，我以問答形式介紹基因克隆及其常見問題，希望對(duì)大家有所幫助。Q1：如何獲取一個(gè)已知基因的序列？A1：...
7-24
1雜交溶液或洗滌溶液在使用前未預(yù)熱2探針濃度過高或探針未變性。將雜交液裝入雜交管時(shí)，體積減少，探針濃度發(fā)生了變化，應(yīng)確保相應(yīng)地調(diào)整探針濃度。3未從探針溶液中去除未結(jié)合核苷酸。4預(yù)雜交和雜交溶液中的預(yù)雜交或阻斷劑不足，充分的預(yù)雜交對(duì)于阻止膜的非特異性雜交非常重要。5雜交或洗脫條件不夠嚴(yán)格：6降低鹽濃度。7提高溫度。8增加SDS的濃度。9增加洗脫次數(shù)。10膜太干燥，這通?？赡苁敲黠@重疊問題的原因，可能由以下原因引起：11探針體積太小。溶液更換速度太慢，尤其是批量更換處理時(shí)分子雜交...
7-24
1放射自顯影期間膜對(duì)膠片的曝光時(shí)間不足。2核酸轉(zhuǎn)移或結(jié)合在尼龍膜上的效率低3目標(biāo)序列以非常低的拷貝數(shù)存在。增加加載到凝膠上的樣品量。4沒有足夠數(shù)量的探針序列，增加探針的濃度或加入10%硫酸葡聚糖，這樣減少了溶劑體積，可以到到相同的效果。5沒有探針同源性。6雙鏈DNA探針未變性，或者，探針檢測儀性能下降。在使用RNA探針時(shí)發(fā)生可能更大。7探針的比活性太低?？紤]諸如標(biāo)記反應(yīng)中的探針濃度、放射性標(biāo)記的三磷酸鹽的半衰期等因素。8雜交和/或洗滌過程中試驗(yàn)方法不佳：1）增加鹽的濃度。2）...
7-23
常見問題Q1：標(biāo)記方法有哪幾種？A1：（1）切口平移法（2）隨機(jī)引物法（3）末端標(biāo)記法（4）單鏈DNA探針標(biāo)記（5）寡核苷酸探針標(biāo)記法Q2：探針標(biāo)記物的分類有幾種？A2：（1）探針標(biāo)記物有放射性核素與非放射性物質(zhì)兩種。放射性核素標(biāo)記敏感性高，可檢測pg水平的核酸，但因不易長期保存，且存在放射性污染等問題，現(xiàn)已較少應(yīng)用。（2）非放射性物質(zhì)常用的有生物素、地高X等，非放射性探針安全、穩(wěn)定、操作方便并且經(jīng)濟(jì)，但敏感性較低，近年來，由于雜交信號(hào)檢測方法的改進(jìn)，檢測的敏感性得到了很大提...
7-23
核酸雜交(Nucleicacidhybridization)，又稱核酸分子雜交。威尼德分子雜交儀原理：是核酸變性和復(fù)性理論。雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開形成單鏈，當(dāng)理化因素消除后，具一定同源性的兩條(探針和待測核苷酸序列)單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度條件下，可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異性地復(fù)性形成雙鏈。核酸分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行。分類：核酸分子雜交按作用環(huán)境不同分為固相核酸分子雜交和液相核酸分子雜交。一、固相核酸分...
7-23
硝酸纖維素膜(nitrocellulosefiltermembrane，簡稱NC膜)，NC膜在NorthernBlot、SouthernBlot、WesternBlot中都需要用到，雜交技術(shù)有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術(shù)目前較為常用，先將待測核酸結(jié)合到一定的固相支持物上，再與液相中的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜。PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride）是蛋白質(zhì)印跡法中常用的一種固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有...
7-23
Q1:PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？A1:一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，若反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，效果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF膜即帶正電荷的尼龍膜），同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì)較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，效果較好。Q2:做組織樣品的westernblot的時(shí)候，處理樣品有什么訣竅？A2:必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低...
7-23
經(jīng)典實(shí)驗(yàn)步驟是將提取的蛋白電泳—轉(zhuǎn)膜---一抗孵育---二抗孵育---底物顯色---分析。我這幾天幾乎都在重復(fù)著這個(gè)過程，現(xiàn)在將自己試驗(yàn)過程記錄下來，和大家一起分享，希望對(duì)新手有所幫助。1.蛋白提取傳統(tǒng)方法是(1)組織稱重(2)利用液氮、研缽粉碎組織塊(3)加入RIPA緩沖液，PMSF(4)勻漿（15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘）維持4℃(5)加入PMSF冰上孵育30分鐘，移入離心管4℃離心15分鐘(6)上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存。一部分進(jìn)行Bradford比色法測定蛋白...
